Zellbasierte Untersuchungen
Beschreibung
Diese Anwendung beschreibt die High-Content-Screening Lösung, angewandt auf Cytotoxitzitäts-Assays mit Verwendung lebender Zellen. Daten generiert mit der labelfreien DHM® Bildgebung werden mit Daten basierend auf der Fluoreszenz-Methode verglichen.
Labelfreie DHM® Bildgebung ist eine vorteilhafte Methode für’s phenotypische (Morphologie basierte) Screening lebender Zellen für diverse High-Throughput-Screening (HTS) und High-Content-Screening Anwendungen. In dieser Application Note zeigen wir, wie einfach das DHM® Zelllebensfähigkeits-Daten generiert, absolut vergleichbar mit Daten aus Fluoreszenz basierten Methoden, nur viel effizienter.
Mit der DHM® Technologie kann ein bedeutender Teil der frühen Medikamentenentwicklung angegangen werden. Zum Beispiel ist der Zelltod von grosser Wichtigkeit fürs Profiling bioaktiver Substanzen, die Suche nach cytotoxischen Substanzen in der Krebsforschung, aber auch cytoprotektive Substanzen für therapeutische Anwendungen.
Material und Methoden
- Zelle HELA, H9c2
- Selektierte toxische Kompounds für DHM® Endpunkt- und Zeitraffer-Messungen im Vergleich mit Fluoreszenz basierten Methoden: HgCl2, Chloroquine, Gambogic acid, Doxorubicin, Cycloheximide
- DHM® Lösung: HCS System ausgestattet mit optionalem Fluoreszenz Modul
- Automatisierter XY Tisch und Klimakammer für Temperatur und CO2 kontrollierte Umgebung (Chamlide WP incubator system, LCI). Einsatz von kommerziell erhältlichen 96 und 384-Wellplatten (BD-Falcon imaging plates)
- Daten Acquise: Bestimmung Lebendzell-Anteil mit dem DHM®: labelfrei, kein Labeling nötig. Aufnahme des OPD Signals und Zell-Konfluenz. Bestimmung der Zellviabilität mit Fluoreszenz: PrestoBlue für Total Well-Signal Messungen mit Safire2 (Tecan) Multimode Reader; Hoechst 33342 und Propidium Jodid fürs Zellen-Labeling aufgenommen mit einem BD Pathway 435 automatisierten Mikroskop.
- Daten Analyse: Bild-Segmentierung, Quantifizierung und Analyse über die Open-Source-Software CellProfiler (www.cellprofiler.org) für beide, DHM® und Fluoreszenzmikroskopie-Messungen. Quantitative-Zellpopulations-Analyse kann mit den DHM® Aufnahmen gemacht werden über das Messen der Konfluenz sowie dem Signal OPD (optical path difference) für beide, Endpunkt- und Zeitraffermessungen.
- Screening-Daten Gruppierung: Kompounds wurden anhand ihres Phenotyps gruppiert: Konfluenz vs. OPD Signal für eine bestimmte Zelllinie, und OPD Signal für eine bestimmte Zelllinie gegen OPD für eine weitere Zelllinie.
Ergebnisse
Bei der Validierung des DHM® zur Eignung zum Phenotyp Screening wurde ein Z’-Faktor von fast 0.9 erzielt beim Test zur Zellviabilität mit HeLa und H9c2 Zellen in 96 oder 384 Wellplatten. IC50 Kurven für ausgewählte Kompounds sind in excellenter Übereinstimmung mit dem DHM® und Standard-Fluoreszenz basierteren Methoden [1]. Cluster-Bildung von Kompounds in OPD vs. Konfluenz-Kurven (hinweisend auf Cytotoxizität oder aber Zellteilung) für das ganze Screening von 1200 Kombinationen erlauben eine vorab Klassifizierung der Kompounds basierend auf dem Wohlergehen resp. nicht und ermöglichen schon mal eine Vorselektion von Hits für weitere Analysen wie Dosis-Antwort und Zeitraffer-Messung (Fig.3). Vergleichende Screens mit unterschiedlichen Zelltypen erlauben die Selektion gewünschter Kompounds anhand der erhaltenen Phenotypen wie illustriert als ein Prinzip-Beweis für die toxikologische Aussagekraft. Des Weiteren erlauben die viel Information enthaltenden analysierten Daten Einsicht in die generierten Phenotypen mit möglicher Indikation zum Wirkmechanismus eines Wirkstoffs auf einen bestimmten Zelltyp. Was zur sachgerechten Annotation der Kompounds betreffend Selektion oder Priorisierung erhaltener Hits beiträgt.
Schliesslich ist die bequeme Verwendung des DHM® für Zeitraffer Experimente über mehrere Tage unter verschiedenen Konditionen ein nicht zu vernachlässigender Aspekt in Bezug auf das Echtzeit-Monitoring von Vorgängen in den Zellen im Zusammenhang mit den zugegebenen Kompounds [2].
In Summe ist die labelfreie, quantitative DHM® Screening Methode eine vorteilhafte Technik, indem sie sowohl HTS wie auch HCS Daten liefert und so dem Anwender einen klaren Mehrwert bietet.
Fig 3 : Zeitraffer-Aufnahmen mit Dosis-Antwort Kurven für Doxorubicin in HeLa Zellen. Gemittelter OPD ist das rohe DHM Signal über die ganze Zellpopulation, wohingegen die Phenotypisierung (entspricht der Cytotoxizität) nur über die zeitaufwändige Klassifizierung der Einzelzellen geht, mit Zellprofiler unter Benützung derselben Daten-Sets.
Publikationen
[1] Label-Free Cytotoxicity Screening Assay by Digital Holographic Microscopy
[2] Digital Holographic Microscopy: A Quantitative Label-Free Microscopy Technique for Phenotypic Screening
Labelfreie Cytotoxizität-Screening mit dem Digitalen Holographischen Mikroskop
Labelfreie Cytotoxizität-Screening-Assay mit Digitaler Holographischer Mikroskopie
Wir haben eine labelfreie Technologie, basierend auf digitaler holographischer Mikroskopie (DHM), für bildgebendes Screening, und zeigen ihre Eignung mit Cytotoxizitäts-Tests an Säugerzellen. Für dieses erste High-Content-Screening …
Digitale Holographische Mikroskopie: Eine quantitative, labelfreie Mikroskopie-Technik für Phenotypic-Screening
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Digitale Holographische Mikroskopie (DHM) ist eine labelfreie bildgebende Technik, die die Visualisierung transparenter Zellen in klassischen Zellkultur-Platten erlaubt. Das quantitative DHM Phasenkontrast-Bild basiert sowohl auf dem intrazellularen Brechungs …
Beschreibung
Zellmigration ist zentral für eine Anzahl Funktionen wie bei der Wundheilung, Zellteilung, Embryo Entwicklung, aber auch beim Tumor mit den Metastasen. Ein besseres Verständnis des Mechanismus, bei dem Zellen migrieren, kann zu neuen Therapie Ansätzen führen, insbesondere in der Krebsforschung, wo migrierenden Zellen eine Hauptrolle zukommt.
Die gezeigte Screening-Applikation mit dem labelfreien DHM® stellt eine schnelle, informative Nachweismethode für Verbindungen dar, die die Zellausbreitung, Migration, aktiv hemmen. Dies sowohl mit Zeitraffer- wie Endpunkt-Aufnahmen. Dazu können die gefundenen aktiven Kompounds kategorisiert werden in Bezug auf ihre Wirksamkeit über Dosis-Wirkungs-Antworten wie auch über die erhaltenen Phenotypen. Alle Ergebnisse kommen allein aus der gemittelten OPD Information (optical path difference).
Zusammengefasst, lassen sich mit unserer Methode einfach & kostengünstig Charakterisierungen von Hits auf deren Eignung vornehmen, Zellmigration wirkungsvoll zu hemmen. Und mit denselben Messungen gleichzeitig phenotypische Zelländerung, hervorgerufen durch den chemischen Effekt des Wirkstoffs, dokumentieren.
Material und Methoden
- Zellen: HeLa Zellen plated in OrisTM-Pro 96-Wellplatten (Platypus Technologies). Kurzzeitiger Einsatz von Silikon basierten Stoppern, um das Well-Zentrum zellfrei zu halten und aussen rum einen ringförmigen Monolayer-Zellen zu haben, die sich ins Zentrum bewegen können.
- Toxische Kompounds für die Zell-Vorbereitung: Zellen wurden für 40 h zunehmender Konzentrationen von Cytochalasin D (n=3) ausgesetzt. Dies ist ein die Zellen durchdringender potenter Blocker der Polymerisation und Dehnung des Actin, was zum Unterbruch des Zellzyklus führt (beim G1-S Übergang) durch die Aktivierung des p53-abhängigen Durchgangs.
- DHM® Lösung: HCS System. Bildaufnahme und Analyse mit einem 10x/0.22 NA Objektiv, 25 Bilder pro Well mit etwa 2 Bilder/Sekunde, was eine Gesamtzeit von 20 Minuten ergibt für die 2400 Bilder der 96 Wellplatte. Zeitpunkte waren jede Stunde über die 40 h. Konfluenz, das Auslesen der Migration, wurde über simples Schwellenwert setzen bei den Bildern mit dem gemittelten OPD erreicht, die Cytotoxizität wurde über das gemittelte DHM® Signal gemessen.
Resultate
Eine ganze Wellplatte wurde im Zeitraffer-Modus unter verschiedenen Testkonditionen vermessen. Der EC50 Wert, berechnet von der Dosis-Antwort-Kurve am Endpunkt der 40 h für Cytochalasin D, ist in Übereinstimmung mit früher publizierten Daten. Hochdurchsatz-Daten mit zeitlicher und räumlicher Information wurden ganz einfach mit unserer labelfreien DHM® Methode generiert. Chemische Kompounds zur Verhinderung von Zellmigration können gefunden und auf deren Wirksamkeit hin überprüft werden. Ausserdem können über die Zeitraffer Messungen phenotypische Änderungen an den Zellen dokumentiert werde, nützliche Zusatzinformation über das Agieren des Kompounds während einer bestimmten Zeit und Konzentration.
Unsere Methode ist geeignet für umfangreiche Screenings mit Single-Kompound-Konzentration und mit Fokus auf Hochdurchsatz-Datenanalyse von ausgewählten Molekülen in Hits-Validierung oder Hits-zu-Leads Prozess.
