Phasenmikroskopie
DHM® ist eine Phasen-Mikroskopie-Technik, die neben dem Intensitätskontrast echte Quantitative-Phasen-Messungen (QPM) bietet.
Weshalb enthält die Holographie Phasen Information ?
Holographie kommt vom griechischen Wort “holos” und bedeutet alles, das Ganze, und “graphy” bezeichnet den Schreib- oder Aufnahme-Vorgang. Die gesamte Information einer Welle besteht aus ihrer Wellenlänge, ihrer Amplitude, ihrer Phase und ihrem Zustand der Polarisation. Dennis Gabor erhielt den Nobelpreis, weil er einen Weg fand, beides, die Phasen- und die Intensitäts-Information, auf einem Substrat festzuhalten, das nur empfindlich für die Intensität war (genannt Hologramm); heute sind dies digitale Kameras. Angewandt mit einer kohärenten Lichtquelle, erlaubt die digitale Holographie die Aufnahme sowohl der Amplituden- wie auch der Phaseninformation über das gesamte gemessene Bildfeld.
Weshalb ist die Phase einer Welle so relevant ?
Die Phase kann als Position der Welle als eine Funktion der Zeit betrachtet werden. Mit dem Wissen der Geschwindigkeit des Lichts kann man Distanz messen, und somit die 3D Topographie des Sample bestimmen. Es ergibt die geometrische Information mit der Wellenlänge als vertikaler Referenz. Sub-Nanometer vertikale Auflösung kann erreicht werden.
Des Weiteren wird die Phase (und die Amplitude) des Lichts beim Weg durch respektive reflektiert vom Sample von dessen dielektrischer Konstante (Brechungsindex) beeinflusst und liefert damit relevante Information zu den Materialeigenschaften des Sample.
Weshalb ist die Phase quantitativ und absolut ?
Die Topographie ist verknüpft mit der Phase über eine sehr gut definierte, präzise kalibrierte Länge: die Wellenlänge der Belichtungsquelle. Im Gegensatz zu einer Intensitätsmessung sind die Einheiten nicht beliebig, hängen nicht von der Beleuchtungsstärke ab, nicht von der Aufnahmeempfindlichkeit oder der nachfolgenden Verstärkung des vom Sample zurückerhaltenen Signals.
Was ist QPM (Quantitative Phasen Messung) ?
QPM ist die Differenz der Phase bei der Wellenfront innerhalb des Messbereichs. Ihre Interpretation erlaubt Rückschlüsse auf die Sample Geometrie, die Materialeigenschaften im Falle von Material Science und auf die zelluläre Morphologie und Inhalt im Falle von Life Science. Die Anwendung von QPM in Material- wie Life-Science wird in den beiden Tabs erklärt. QPM wird auch OPD (Optical Path Diffrence) genannt, speziell im Gebiet Life Science.
Ist die Periodizität der Welle eine Limitierung ?
Die Phase ist bei Definition periodisch. Das heisst, es gibt eine potentielle Mehrdeutigkeit beim Messen einer Distanz. Viele Leute glauben, sie kann nicht für Messungen verwendet werden, bei denen Höhen grösser als die Wellenlänge vorkommen. Aber für viele Anwendungen ist das nicht wirklich der Fall. Eine erste mathematische Technik, genannt Phasen unwrapping, ist in der Koala Software enthalten und eignet sich für tendenziell sanftere Topographie. Sie ermöglicht Topographie mit Höhenunterschied klar über hundert Mikrometer zu messen. Eine zweite Technik mit dem Multi-Wellenlängen DHM® ermöglicht das Messen rauherer Oberflächen und Samples mit Stufen.
Das DHM® misst die Samples optisch. Die Interpretation hängt von der DHM® Konfiguration ab (Auflicht oder Durchlicht), aber stellt sowohl Geometrische- wie auch Material-Information bereit.
Phasen Interpretation für DHMs in Auflicht Konfiguration
Zeichnung 1 : Messprinzip Auflicht
Zeichnung 1 illustriert das Prinzip der Phasenmessung beim DHM® in der Auflicht Version an einem homogenen, spiegelnden Sample, beleuchtet mit einer monochromatischen, planaren Welle mit der Wellenlänge λ. Dabei wird die Wellenfront, deformiert von der Sample Oberfläche, zurückgeworfen. Diese Deformation nennt sich Dephasing Δφ. Für ein homogenes Sample ist das Dephasing linear zur 3D Topographie des Sample’s und drückt sich in der Formel aus:
Δh = λΔφ / 4π n
wo Δh die Höhe des Sample ist und n der Brechungsindex des Immersions-Mediums ist (n = 1 in Luft, 1.33 in Wasser). Für nicht-homogene Samples müssen die physischen Charakteristiken der Oberfläche in Betracht gezogen werden (Reflektometrie Analysen).
Phasen Interpretation für das DHM® in Durchlicht Konfiguration
Zeichnung 2: Messprinzip beim Durchlicht
Zeichnung 2 illustriert das Prinzip der Phasenmessung beim DHM® in der Durchlicht Version, an einem homogenen, transparenten Sample, mit dem Brechungsindex n2, und beleuchtet mit einer monochromatischen, planaren Welle mit der Wellenlänge λ. Die Wellenfront wird deformiert beim Weg durch das Sample. Diese Deformation in Bezug auf die einfallende Welle, gemessen in Grad oder Radian, nennt man Dephasing Δφ. Für ein homogenes Sample ist das Dephasing direkt gekoppelt zur 3D Dickenvariation Δh und drückt sich in der Formel aus:
Δh = (λΔφ) /[2π (n2– n1)]
wo Δh die Höhe (Dicke) des Sample ist und n1 der Brechungsindex des Immersions-Mediums (n1=1 in Luft, 1.33 in Wasser).
Licht, das durch ein Sample hindurch geht, wird üblicherweise sowohl Amplitude wie auch in der Phase modifiziert. Bei Zellstrukturen allerdings, die überwiegend hoch transparent sind und kein Licht absorbieren, ändert sich allein die Phase und die Amplitude bleibt unbeeinflusst. Deshalb nennt man Zellen auch „Phasen Objekte“, was bedeutet, dass sie mit einem klassischen Hellfeld-Mikroskop nicht sichtbar sind . Um diesen Nachteil zu überwinden, hat Frits Zernike (Nobelpreis 1953) das Phasen-Kontrast-Mikroskop in den frühen 1930 Jahren erfunden. Es ermöglichte es Biologen, durch Zellstrukturen hervorgerufene Phasenänderungen zu visualisieren.
Wie in ihrem Namen enthalten, zeigen Phasenkontrast-Mikroskope (Zernike, Nomarski oder Ddifferential Interference Contrast (DIC) oder Hoffman modulation contrast Mikroskope) zwar Details der Samples, nicht aber absolute und quantitative Messungen, basierend auf der modifizierten Phase bei ihrem Weg durch das Sample. Im Jahr 1950 beschrieb J. Dyson gut die Limiten solcher Phasenkontrast Ansätze und lancierte ein interferometrisches Mikroskop für Quantitative-Phasen-Messungen (QPM). Diese ersten QPM Mikroskope waren aber nicht einfach zu bedienen fürs zellulare Imaging, wenn man die intrinsisch kurze Kohärenz der damals zur Verfügung stehenden Lichtquellen in Betracht zieht, nötig, um Referenz- und Objekt-Wellenfront zu überlagern. Und natürlich war damals die heute so effiziente digitale Aufnahme + Prozessierung nicht verfügbar. Die erste biologische Interpretation der QPM ermöglichte das Barer System im Jahr 1952.
Aufgrund der einerseits schwierigen Handhabung dieser frühen QPM Mikroskope und der andererseits schwierigen Interpretation der Messergebnisse hinsichtlich der zugrunde liegenden biologischen Prozesse, flachte das Interesse an QPM Mikroskopen wieder ab und verlagerte sich in Richtung Marker zum Sichtbarmachen der biologischen Strukturen.
In den frühen 1990 Jahren arbeiteten die späteren Gründer von Lyncée Tec an der Entwicklung des DHM® für schnelles QPM. Sie waren die Ersten die aufzeigten, dass QPM Messungen von einem einzigen Hologramm mit der sog. off-axis digitalen Holographie funktioniert und patentierten dies. Parallel dazu arbeitete die Gruppe intensiv an der Interpretation von QPM in Life Science. Die wichtigsten Schritte zu diesen Interpretationen sind nachfolgend beschrieben. Ermöglicht hat sie das DHM® Gerät von Lyncée Tec.
Intrazellularer Inhalt
Das Originalexperiment publiziert bei Barer wurde mit dem DHM® von Lyncée Tec wiederholt. Die erste Experimente Serie wurde an Hefekulturen durchgeführt. Sie bestätigten, dass QPM das direkte Messen des Proteingehalts in Hefe erlaubt, und damit über Langzeit-Monitoring die Protein Produktion und Konzentration im zeitlichen Verlauf aufzeigt, und zwar quantitativ, labelfrei und strikt nicht-invasiv. Eine zweite Experimente Serie betraf rote Blutkörperchen (RBCs) – Hemoglobin Konzentrationsmessungen. Die Messergebnisse wurden validiert mit Ergebnissen aus Messungen mit alternativen Messsystemen.
Zellulare Morphologie und intrazellulare Konzentration
Der gemessene Phasenwert bei QPM Systemen hängt sowohl vom gemittelten intrazellularen Brechungsindex wie auch der Zelldicke ab. Die erste Stossrichtung von mit dem DHM® von Lyncée Tec arbeitenden Forschern war naheliegenderweise eine Methode zu finden, wie Zelldicke und die gemittelte Information des intrazellularen Inhalts auseinandergehalten werden können. Dies gelang über mehrere Methoden und wurde auch publiziert [Rappaz, Boss 2013]. Angewandt wurde sie zuerst an strikt nicht-invasiven Zeitraffer-Messungen über Zellmorphologie und Zellvolumen.
Eine massgebliche Erkenntnis dieser Studie ist, dass für kurze Zeitabschnitte, typischerweise ein paar Minuten (also ohne messbare Protein Produktion), die QPM viel sensitiver auf Änderung des intrazellularen Inhalts als auf Änderung der Morphologie ist. Diese wichtige Erkenntnis zeigte sich schön in einer Publikation, bei der eine hypotonische Lösung an Maus-Neuronen appliziert wurde. Die Messung zeigt eine starke Abnahme des Phasensignals, wo doch gut bekannt ist, dass das Zellvolumen in diesem Fall zunimmt. Alle im folgenden Abschnitt gezeigten Beispiele verweisen auf diesselbe interessante Begebenheit.
Membran Aktivität
Wie gesagt, QPM Variation kann direkt auf eine Änderung der intrazellularen Flüssigkeit zurückgeführt werden. Mehrere Publikationen in den letzten Jahren haben gezeigt, dass das DHM® Gerät von Lyncée Tec folgende Messungen ermöglicht:
- Transmembrane Flüsse: Ionen, wandernd durch Membranen, werden mit einer bekannten stöchiometrischen Menge an Wassermolekülen hydratisiert. Jeder Ionenaustausch durch die Membrane erhöht / verringert die Wassermenge in der Zelle und verändert damit die intrazellulare Konzentration. In mehreren Publikationen [Pavillon 2010, Jourdain 2011, 2013] wurde gezeigt, wie Phasenmessungen das Monitoring der Ionenkanal-Aktivität ermöglichen.
- Wasserflüsse: der Membran-Wasseraustausch ändert unmittelbar die intrazellulare Konzentration und kann damit direkt mit dem DHM® gemessen werden, gezeigt in mehreren Publikationen [e.g. Jourdain 2013]
- Co-Transporter: das Monitoring von Co-Transporter Aktivität wird in mehreren Publikationen gezeigt [Jourdain 2011]
- Zellviabilität: das Überleben von Zellen basiert stark auf ihrer Fähigkeit, externe Einflüsse mit dem Aktivieren von Kanälen auszubalancieren. Das Fehlen solcher Regulationsprozesse ist gleichbedeutend mit Zelltod und wird meistens begleitet mit unumkehrbarer Änderung der intrazellularen Konzentration. Was mit dem DHM® gemessen werden kann, das zeigen mehrere Publikationen [Kuhn 2011, Pavillon 2012, Rappaz 2013].
Innovative Forschung
Viele weitere innovative Applikationen wurden mit dem DHM® untersucht und waren nützlich für die Interpretation der zugrundeliegenden biologischen Prozesse:
- Pollen Erkennung [Charrière 2005]
- RBC Membran Flimmern für Krankheits Diagnose [Rappaz 2009, Boss 2012]
- Polarisation und Depolarisation von biologischen Samples [Jordan 2012].
Lyncée Tec und zugehörige Forscherteams sind stolz auf ihre Pionierrolle in der Entwicklung des DHM® Geräts und den nachfolgenden, hoch interessanten QPM Interpretationen in Life Science.
