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Beschreibung

• Zellmigration ist zentral für eine Anzahl von Funktionen wie Wundheilung, Zellteilung, embryonische Entwicklung, aber auch Metastasen eines Tumors. Ein besseres Verständnis des Mechanismus, bei dem Zellen migrieren, kann zur Entwicklung neuer Therapie Ansätze führen, so in der Krebsforschung, wo das Verständnis der Migration von Zellen in Tumoren und Metastasen ein Ansatz zur Krebsbekämpfung sein kann.

In der Anwendung hier zeigt das DHM, dass seine labelfreien Aufnahmen schnell und unkompliziert zum Aufspüren von Verbindungen führen, welche eine Wucherung und Migration entarterter Zellen verlangsamen oder gar verhindern. Und: die gefundenen Verbindungen können auch auf ihre Wirksamkeit hin kategorisiert werden, einerseits über ihre Dosis Wirkung, andererseits über den Phenotyp. Diese Informationen lassen sich direkt aus der OPD Information gewinnen, ohne Post-Processing Analyse.

Zusammengefasst lassen sich mit dem DHM einfach und effizient die Wirksamkeit gefundener, als wirksam erachteter Verbindungen zum Unterdrücken der Zellmigration, überprüfen. Hilfreich dazu ist das Beobachten der phenotypischen Zelländerung, hervorgerufen durch die verwendete chemische Verbindung.

Material und Methoden

• • • Zellen: HeLa Zellen in Oris^TM-Pro 96-Wellplatte (Platypus Technologies). Kurzzeitig eingesetzte Silikon basierte Stopper verhindern eine Zellansammlung im Zentrum, so dass sich eine ringförmige Anordnung zum Rand hin und einer zellfreien Mitte ergibt, in die sich die Zellen hin bewegen können.
    • Toxische Verbindungen benutzt für die Zellbehandlung: Zellen wurden über 40 h mit zunehmender Konzentration mit Cytochalasin D (n=3) behandelt. Diese Verbindung ist ein Zellen durchdringender potenter Blocker der Polymerisation und dehnt das Actin, was den Zellzyklus (beim G1-S Übergang) durch die Aktivierung von p53-abhängigen Leitungswegen unterbricht.
    • DHM Lösung: Bildaufnahme und Analyse: mit einem 10x/0.22 NA Objektiv wurden 25 Bilder pro Well aufgenommen mit etwa 2 Bilder/sec, was eine Gesamtzeit von 20 Minuten für die total 2400 Aufnahmen der gesamten 96 Wellplatte ergibt. Messzeitpunkt war jede Stunde über die 40 Stunden. Konfluenz, das Auslesen der Migration, wurde über simple Schwellenwertbildung über den gemittelten OPD gemacht, bezüglich Cytotoxizität wurde das gemittelte DHM Signal verwendet.

Resultate

Eine gesamte Wellplatte wurde im Zeitraffer Modus für die verschiedenen Assay Konditionen aufgenommen. Der berechnete EC50 Wert aus der Dosis-Antwort-Kurve beim Endpunkt 40 h für das Cytochalasin D ist in Übereinstimmung mit früheren veröffentlichten Daten. Viel zeitliche und räumliche Information erhielten wir mit unserer labelfreien DHM Aufnahme Methode auf einfache Art und Weise. Chemische Verbindungen zum Verhindern von Zellmigration können evaluiert und auf deren Wirksamkeit hin quantifiziert werden. Ausserdem lassen sich über die Zeitdauer der Messungen einfach phenotypische Änderungen an den Zellen dokumentieren, was nützliche Zusatzinformation über die Wirkung der Verbindung in Bezug auf Konzentration und Zeit generiert.

Unsere Methode ist geeignet für umfangreiches Screening mit single Kompound Konzentration, mit Fokus auf Hochdurchsatz-Analyse von ausgewählten Molekülen für Hit-Validierung oder Hits-to-Leads Prozesse.

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